实验做到崩溃?这 10 个技巧让做出发表级 WB 图

01

快速处理您的组织

使用干净的工具收获和处理组织样本。要去除可能影响蛋白质稳定性的污染物，请在冰冷的中性 pH 缓冲液中短暂洗涤。洗涤后，在液氮中快速冷冻组织，以保留蛋白质结构和特征，例如翻译后修饰（PTM）。组织样本可以保存在冰上，以便立即匀浆；然而，由于蛋白质降解仍可能在 –20 °C 下发生，因此组织样品应保存在 –80 °C 以长期储存。

02

仔细选择裂解缓冲液

在选择最佳裂解缓冲液以有效地从组织中提取蛋白质时，请考虑 pH、离子强度以及去垢剂和变性剂类型等参数。RIPA 缓冲液是使用最广泛的裂解缓冲液。在缓冲液选择过程中，还应考虑靶蛋白的细胞定位；例如，对于细胞质蛋白，推荐使用 Tris-HCl 裂解缓冲液，而 RIPA 是提取核蛋白的首选。为了富集膜、胞质或细胞核部分中的低丰度蛋白质，可能需要组织分级分离。裂解缓冲液的量基于组织的大小/重量；考虑缓冲液与组织的比例对于确保有效裂解非常重要。首次建立从组织中提取蛋白质的方案时，请尝试使用不同的裂解缓冲液，以优化组织类型和特定蛋白质的条件。

03

选择最佳破碎组织方法

由于与细胞相比，样品结构程度更高，因此组织需要更严格的破碎方法，如均质化技术。为了进一步解离组织并剪切细胞 DNA，可能需要对样品进行超声处理。在此步骤中避免起泡很重要，因为它可能会降低您的回收量。确保已优化机械破碎机的电源设置并使用预冷设备。

由于脂质会影响蛋白质免疫印迹的质量，因此请确保去除样品中的脂肪。从植物组织中提取蛋白质特别具有挑战性，因为它们富含蛋白酶并且含有高水平的代谢物，可以干扰蛋白质提取（Wang 等人，2008）。提取过程必须针对您使用的特定植物组织进行优化。已经为植物组织开发了几种蛋白质提取方案，例如三氯乙酸/丙酮沉淀法或基于苯酚的提取（Wang 等人，2008）。

04

在样品制备过程中抑制蛋白质降解并保留翻译后修饰

细胞膜的破坏释放出可以降解蛋白质的酶，尽管通过将样品保持在低温下来最小化其活性（Scopes 1994）。为了限制蛋白酶活性，可以在缓冲液中加入强变性剂，如尿素。然而，这些条件可能会影响某些蛋白质的完整性；因此，裂解缓冲液常规补充蛋白酶抑制剂混合物。常见的蛋白酶抑制剂包括（PMSF），aprotinin，leupeptin，and pepstatin。

SUMO 化蛋白的鉴定可能特别具有挑战性。这是由于去除 SUMO 偶联物的异肽酶的活性，并且通常只有一小部分蛋白质被 SUMO 化。因此，为了保存 SUMO 化，建议在裂解缓冲液中添加 isopeptidase inhibitors（Xiao 等人，2015）。泛素偶联物的去除也很容易通过蛋白质泛素水解酶（称为去泛素酶（DUB））发生。因此，必须在细胞裂解缓冲液中添加 EDTA 或 EGTA 以及碘乙酰胺（IAA）或 N-乙基马来酰亚胺（NEM）。IAA 和 NEM 通常以 5～10 mM 的浓度使用。然而，高达十倍的高浓度对于维持某些蛋白质的泛素化至关重要，例如 IRAK1（Emmerich 和 Cohen 2015）。用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理也保留泛素化并阻止 26S 蛋白酶体的蛋白质降解（Kisselev 等人，2012）。

05

在凝胶上样前定量样品

测定样品浓度可确保凝胶的上样量相等，并使您能够比较处理样品与未处理样品中或实验时间过程中蛋白质水平的差异。Bradford assays，如 Bio-Rad 的 Quick Start Bradford Protein Assay，可用于每孔总蛋白质上样量的标准化。

06

寻找最好的凝胶

确定最适合目标蛋白的凝胶的一个很好的起点: 根据蛋白质的分子量选择聚丙烯酰胺百分比。例如，对于高分子量，选择低百分比，对于低分子量，选择高百分比。如果要检测单个蛋白质，请选择非梯度凝胶。当需要可视化一系列蛋白质大小时，选择梯度凝胶。非常高的电压设置可能会导致凝胶「微笑」；为避免这种影响，请在冷藏室中电泳凝胶并使用预冷的电泳缓冲液。

07

验证蛋白质上样量

根据蛋白质的细胞定位选择最佳上样对照。细胞质蛋白的常用上样对照包括管家蛋白，例如 beta-actin 或 beta-tubulin；对于核蛋白，通常使用 histone H1 或 histone H3。近年来，许多研究报告了一些最常用的管家蛋白不适合当做可靠的蛋白质归一化，强调生理和病理因素会影响它们的表达水平（Ferguson 等人，2005）。为了使加载归一化有意义，必须在不同的实验条件下保持恒定的水平；例如，加载控件的表达不应受到处理的影响。即使在单个组织样本中，beta-actin 表达也被证明不是均匀的（Eaton 等人，2013）。此功能突出了使用管家蛋白进行比较蛋白质水平分析的问题。

管家蛋白的另一个常见问题是过载，这会导致检测超出动态范围。样品的动态范围取决于组织和蛋白质测定方法。

Bio-Rad 的免染成像技术是 Bio-Rad 的免染成像技术，是用染料（如 Ponceau S）观察蛋白质和蛋白质装载可视化的一个很好的替代方案。该技术能够将每个泳道中的条带标准化为总蛋白质（图 1，Taylor 等人，2013）。该方法快速，并使用掺入凝胶中的转利染料使蛋白质在 UV 激发时发出荧光。与 Ponceau S 染色相比，免染技术提供了更大的线性范围并减少了可变性（Rivero-Gutierrez 等人，2014 年）。此外，由于不需要对印迹进行染色，因此非常方便。

图 1. 通过免染技术为总蛋白质测量提供线性动态范围。A，HeLa 细胞裂解物稀释 80～2.5 μg 总蛋白。B，HeLa 细胞裂解物从 20～1 μg 总蛋白稀释。

08

考虑膜类型

蛋白质可以转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上。PVDF 膜具有很高的机械强度，最适合需要膜剥离和重新剥离的情况。PVDF 具有疏水性，需要预浸泡在甲醇中。硝酸纤维素膜具有高信噪比，不需要甲醇预处理。需要注意的是，硝酸纤维素膜不能与含有 SDS 的转印缓冲液一起使用。在选择膜类型时，您可能还需要考虑其他参数，例如孔径，这些参数会影响较大蛋白质与较小蛋白质的结合效率。

09

降低内源性免疫球

蛋白的高背景

在对组织裂解物进行蛋白质印迹检测时，来自内源性 IgG 和非特异性二抗结合的信号可能会掩盖对低丰度蛋白质或特定分子量蛋白质的检测。对于 ~50 kD 和 ~25 kD 的蛋白质尤其如此，它们可能会被组织样品制备的变性和还原步骤中产生的 IgG 重链和轻链所掩盖。

然后，IgG 链由与 IgG 重链和轻链结合的常规二抗常规检测。当使用组织样本（例如胸腺或甲状腺）时，这个问题最为明显，这些样本是免疫系统的一部分，因此含有大量的内源性免疫球蛋白（图 2）。

TidyBlot 蛋白质印迹检测试剂（STAR209P 和 STAR209PA）仅与用于蛋白质印迹检测的天然抗体结合，因此为生成干净的组织裂解物印迹提供了良好的解决方案。

图 2. 使用 Immun-Star 山羊抗小鼠（GAM）-HRP 抗体对不同的组织裂解物进行背景染色。

10

包括合适的组织对照

为了确保一抗的特异性，使用阳性和阴性组织对照非常重要。对于阳性对照，请使用文献中指出表达高水平目标蛋白的组织类型、过表达目标蛋白标记的小鼠组织或重组蛋白。推荐的阴性对照包括仅二抗对照（省略一抗孵育步骤）和已知不表达靶蛋白的组织样品。包括特定的敲除样本或组织特异性敲除小鼠模型，通过显示未在某种组织类型中检测到靶标来确认抗体的特异性可能会有所帮助。

您还需要意识到，在疾病状态下存在特定蛋白质表达的定量差异;科学文献中常见的一种现象。为了解释这些差异，您可以包括来自健康和疾病组织的样本来分析异常表达。