绝对定量看标准品

相对定量看内参

qPCR实验灵敏度非常高，一个条件的不同就可能导致实验结果发生改变。为了增加实验可靠性、重复性，按照同一标准对实验条件进行描述就很有必要了。MIQE就是这一国际化标准。

MIQE的由来：2009年，Stephen A等人发表文章《The MIQE Guidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》,文中规定了qPCR结果想要发表需要提供的最少信息，文章一经发表，就得到了大众的认可，现已成为国际化标准。所以想要发表文章的小伙伴就需要先了解下MIQE内容。

MIQE规定：文章投稿时需要同时提交一个清单。该清单分9个部分、85个参数。其中标记为“E”表示必须(essential)，标记为“D”表示建议(desirable)。(点击查看清单)

RT-qPCR通常分为以下五个步骤：1. 样本采集、处理和制备；2. 核酸质量控制；3. 反转录；4. qPCR；5. 数据分析。下面，我们看下每一步所需信息。

1.样本采集、处理和制备

1.采集：来源是哪个物种、器官、组织。并对样本进行简要说明。例如：肿瘤样本描述肿瘤细胞组成比例。

2.处理：提取RNA是用新鲜组织还是冰冻组织，如果冰冻，是如何冰冻的，冻了多长时间。

3.制备：样本如何均质化的，样品目标密度、生理状态、遗传复杂性如何，处理了多少生物量。

2.核酸的质量控制

1.提取：操作环境、试剂、耗材中有无RNase。

2.定量：用何种方法做定量，量是多少。一篇文章中需要用同一种方法来定量RNA。

3.gDNA去除：描述gDNA污染程度。RNA样本是否经过DNase处理(包括DNase类型和反应条件)。

4.质量评估：质量评估方法和结果。推荐使用凝胶电泳或者微流控芯片rRNA分析。

5.杂质残留：杂质残留检测结果。例如：通过稀释样本做反转录来检测PCR抑制剂的存在，或者使用SPUD等抑制试验。

3.反转录

必须要详细描述逆转录的方法和试剂。包括：RNA模板量，引物种类，酶的类型与数量，反应体系以及反应的时间和温度。

4.qPCR

1.基因信息：

基因的数据库登陆信息，目标核酸的结构(如RNA的茎环结构)。目的基因的长度。

2.引物信息：序列和浓度，结合位点。

3.染料或探针：染料种类、探针序列等。

4.实验设计：内参基因的选择、复孔数、阴性阳性对照。

5.反应体系及反应条件：聚合酶的名称和浓度，模板量，缓冲液化学组成，反应体系总量，反应温度及循环数。

6.仪器耗材：塑料耗材的透明度如何，反应容器为单一管、带还是板，制造商是哪家。当使用板时，还需提供板的密封方法。

5.数据分析

数据分析包括审查原始数据，评估质量和可靠性，以及结果分析。在做数据分析时需要提供如下信息：

1.标准曲线：对每一对引物制作标准曲线来分析扩增效率。

2.实验组和对照组的Cq值

3.数据计算方法和归一化方法

4.数据重复性如何

5.统计方法和计算软件

6.术语统一

1.qPCR指的是实时荧光定量PCR，RT-qPCR指反转录qPCR；

2.用于归一化的基因叫做参考基因，而不是管家基因；

3.TaqMan 探针应该被称为水解探针；

4.FRET是荧光共振能量转移探针(fluorescence resonance energy transfer probe)的总称，LightCycler-type探针应称为双杂交探针。

5.不用单词“quantitation”，而使用“quantification” ；

6.描述用于量化的PCR循环数不用Ct、Cp及TOP等单词，建议使用“Cq”来描述。

结语

MIQE指南提供了发表被认可的 RT-qPCR 实验结果所需考虑的所有参数，本篇文章仅罗列了其中的关键条目，作为了解MIQE的引子。鼓励大家深度阅读原文，以期获得理想的实验结果。

为了研究RNA的功能，通常通过逆转录（RT）将RNA转化为更稳定的互补DNA（cDNA）。cDNA可通过克隆、PCR和测序等技术研究RNA，因此，逆转录是许多RNA实验工作流程的关键步骤。

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

在RT-PCR中，通过逆转录（RT）将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增cDNA（图1）。利用cDNA扩增步骤，有望对初始RNA进行进一步研究，即便RNA样本数量有限或低丰度表达。RT-PCR的常见应用包括表达基因检测、转录物变异检测，以及克隆和测序用cDNA模板制备。

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

图1. 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT =逆转录，RTase =逆转录酶

由于逆转录可为PCR扩增和下游实验提供cDNA模板，因此，它是实验成功的关键步骤之一。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率，即便是难转录RNA样本，如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的RNA样本。

一步法和两步法是两种最常用的RT-PCR方法，每种方法都具有各自的优缺点（图2）。

顾名思义，一步法RT-PCR在单个反应管中将第一链cDNA合成（RT）和后续PCR反应结合在一起。该反应设置可简化工作流程、减少结果差异，并将污染的可能性降至最低。一步法RT-PCR简化了大量样本的处理，适用于高通量应用。但是，一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增，将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆转录和扩增条件，因此，一步法RT-PCR在某些情况下可能具有较低的灵敏度和效率。但是，在RT-PCR中使用基因特异性引物，有助于最大化目标cDNA的得率，并最小化扩增背景。

One-step vs. two-step RT-PCR

图2. 一步法和两步法RT-PCR的比较。

两步法RT-PCR包含两个独立反应，首先进行第一链cDNA合成（RT），然后在单个反应管中通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。因此，两步法RT-PCR可用于检测单个RNA样本中的多个基因。RT和PCR反应独立进行，可对每个步骤的反应条件进行优化，使逆转录引物选择（oligo（dT）引物、随机六聚体或基因特异性引物）和PCR反应建立（如DNA聚合酶选择和PCR组分）更灵活。与一步法RT-PCR相比，两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤以及提高污染和结果变异的可能性。

表1. 对比一步法和两步法RT-PCR

两步法RT-PCR

反应建立   单独优化的逆转录和PCR反应

引    物   oligo(dT)、随机六聚体或基因特异性引物

最佳用途   分析多种基因

优    势   灵活

一步法RT-PCR

反应建立 在同时支持逆转录和PCR的条件下，将两个反应结合在一起

引物 基因特异性引物

最佳用途 分析一种或两种基因；高通量平台

优势 方便，高通量