硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)测试盒

微量法100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

TPX属于过氧化物酶家族,在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用,功能与GPX类似,也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内,如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌,在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

测定原理:

TPX催化H2O2氧化二硫苏糖醇(DTT),H2O2的吸收波长为240nm,通过测定240nm吸光度的下降速率,即可计算出TPX活性。

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体120mL×1瓶,室温保存。

试剂二:液体20mL×1瓶,- 20℃保存。

试剂三:液体2mL×1支,4℃。

粗酶液提取:

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。

细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

血清等液体:直接测定。

TPX测定操作:

取微量石英比色皿或96孔板,加入4 μL上清液,180 μL试剂二,16 μL试剂三,迅速混匀后于240 nm测定10s和130s吸光度,记为A1和A2。

TPX活性计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=573×(A1-A2)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min/g 鲜重)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=573×(A1-A2)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=573×(A1-A2)÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷V样÷T

=573×(A1-A2)

ε:H2O2的摩尔消光系数,43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积(L),200 μ L=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),4 μL=4×10-3 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=1146×(A1-A2)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min/g 鲜重)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=1146×(A1-A2)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=1146×(A1-A2)÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。

TPX活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷V样÷T

=1146×(A1-A2)

ε:H2O2的摩尔消光系数,43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积(L),200 μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),4 μ L=4×10-3 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),2min。

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