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高铁还原酶(FCR)测试盒
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
高铁还原酶(ferric-chelate reductase, FCR)催化高价铁螯合物中的Fe3+还原为Fe2+,在部分物种铁元素的吸收中有重要作用。
测定原理:
FCR催化Fe3+还原为Fe2+,Fe2+和ferrozine反应显色,在562nm下有特征吸光值。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体6mL×1瓶,4℃避光保存;
试剂二:液体6mL×1瓶,4℃避光保存;
试剂三:液体6mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
按照组织质量(g):水(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL蒸馏水),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至562nm,蒸馏水调零。
工作液配制:将试剂一、二、三以1:1:1的比例混合。临用前配制,用多少配多少。
在微量石英比色皿/96孔板中,加入50μL样本上清和150μL工作液,混匀,记录初始吸光值A1和30min后的吸光值A2。ΔA=A2-A1。
FCR活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y = 8.0014x + 0.0011,R2= 0.9997;
按样本质量计算
单位定义:每g样本每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。
FCR(nmol/min/g 鲜重)=(△A-0.0011)÷ 8.0014×1000×V标÷(V样÷V样总×W)÷T
= 4.166×(△A-0.0011)÷W
按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg蛋白每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。
FCR(nmol/min/mg prot)=(△A-0.0011)÷8.0014×1000×V标÷(V样÷V样总×Cpr)÷T
=4.166×(△A-0.0011)÷Cpr
V样总:加入提取液体积,1 mL;V样:反应中样品体积,50μL;V标:加入标准品体积 ,50μL;T:反应时间,30min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;1000,μmol到nmol的转换系数。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y = 4.0007x + 0.0011,R2= 0.9997;y,吸光度
按样本质量计算
单位定义:每g样本每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。
FCR(nmol/min/g 鲜重)=(△A-0.0011)÷4.0007×1000×V标÷(V样÷V样总×W)÷T
=8.331×(△A-0.0011)÷W
按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg蛋白每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。
FCR(nmol/min/mg prot)=(△A-0.0011)÷4.0007×1000×V标÷(V样÷V样总×W)÷T
=8.331×(△A-0.0011)÷Cpr
V样总:加入提取液体积,1 mL;V样:反应中样品体积,50μL;V标:加入标准品体积 ,50μL;T:反应时间,30min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;1000,μmol到nmol的转换系数。
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