谷氨酸脱氢酶(GDH)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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谷氨酸脱氢酶(GDH)测试盒

微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

GDH(EC 1.4.1.2)广泛分布于植物中,和谷氨酸合成酶(GOGAT)共同参与谷氨酸的合成,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

测定原理:

GDH催化NH4+、α-酮戊二酸和NADH,生成谷氨酸和NAD+,引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率,计算GDH活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

  2. 样本测定

(1)在试剂二中加入10mL试剂一充分溶解混匀,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用(配好后12h内用完);

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

GDH活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)中GDH活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=643×ΔA

2、组织、细菌或细胞中GDH活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)中GDH活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=1286×ΔA

2、组织、细菌或细胞中GDH活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=2.572×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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