果胶酶测试盒-试剂盒

2024-07-24

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果胶酶测试盒

微量法100T/48S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质酶类的总称,包括原果胶酶,果胶酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类,广泛存在于植物果实和微生物中,主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。

测定原理

果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,具有还原性醛基,与DNS试剂反应生成红棕色物质,在540nm有特征吸收峰,测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存;临用前加入7.5mL试剂一,50℃加热溶解,用不完的试剂4℃保存一周。

试剂三:液体20mL×1瓶,4℃避光保存。

酶液提取

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。

3. 细胞培养液等:直接检测。

测定操作表

对照管

测定管

试剂二(µL)

120

120

50℃水浴温育5min

样本(µL)

30

煮沸样本(µL)

30

混匀,50℃水浴反应30min

试剂三(µL)

150

150

沸水浴5min,冰浴冷却终止反应,8000g,4℃,离心10min,蒸馏水调零,取上清于微量石英比色皿或96孔板测定540nm处吸光值A,△A=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

酶活性计算公式

  1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y = 3.9642x - 0.008;R2= 0.9996;x为标准品浓度,mg/mL;y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008)÷3.9642×V反总÷(V样×Cpr)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h /g鲜重)=(ΔA+0.008)÷3.9642×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按细胞数量计算

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每104细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008)÷3.9642×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量

4.细胞培养液

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+0.008)÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反总:反应总体积,0.15mL;V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,0.5h

  1. 用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y = 1.9821x - 0.008,R2= 0.9996;x为标准品浓度,mg/mL;y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶产。生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008)÷1.9821×V反总÷(V样×Cpr)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h/g鲜重)=(ΔA+0.008)÷1.9821×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按细胞数量计算

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每104细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008)÷1.9821×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量

4.细胞培养液

酶活性定义:在50℃,pH3.5条件下,每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008)÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反总:反应总体积,0.15mL;V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,0.5h

注意事项

  1. 试剂二若有沉淀析出,请置于50℃加热溶解。

  2. 测定之前请先做预实验,如果吸光值较高或较低,请用提取液做适当的稀释或者加大样本量,并在计算公式中乘以稀释倍数或者以实际加入的样本体积参与计算。

  3. 煮沸样本建议在沸水中煮沸10分钟,以将酶灭活。

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