二氢黄酮醇还原酶(DFR)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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二氢黄酮醇还原酶(DFR)测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶,在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。

测定原理

二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素,可与香草醛缩合形成红色化合物,在500nm处有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品

研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯。

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体12mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体1.5mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加2mL蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:液体30mL×1瓶,4℃避光保存。

酶液提取

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定操作表

  1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至500nm。

  2. 操作表

对照管

测定管

酶液(μL)

40

40

试剂一(μL)

140

120

试剂二(μL)

20

试剂三(μL)

20

20

混匀,30℃反应30min

乙酸乙酯(μL)

200

200

37℃震荡10min,取上层溶液,N2吹干

无水乙醇(μL)

100

100

充分震荡

试剂四(μL)

300

300

混匀,25℃静置10min,于微量石英比色皿/96孔板中测定500nm处吸光值A。分别记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管

酶活性计算公式

  1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y=0.0184x+0.0002,R2=0.999

(1)按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2

= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2

= 9.06×(△A-0.0002)÷W

V反总:反应总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,30min

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y=0.0092x+0.0002,R2=0.999

(1)按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0092×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2

= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0092×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2

= 9.06×(△A-0.0002)÷W

V反总:反应总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,30min

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