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二氢黄酮醇还原酶(DFR)测试盒
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶,在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。
测定原理
二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素,可与香草醛缩合形成红色化合物,在500nm处有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品
研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯。
试剂组成和配制
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体12mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体1.5mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加2mL蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体30mL×1瓶,4℃避光保存。
酶液提取
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定操作表
分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至500nm。
操作表
| 对照管 | 测定管 |
酶液(μL) | 40 | 40 |
试剂一(μL) | 140 | 120 |
试剂二(μL) | | 20 |
试剂三(μL) | 20 | 20 |
混匀,30℃反应30min |
乙酸乙酯(μL) | 200 | 200 |
37℃震荡10min,取上层溶液,N2吹干 |
无水乙醇(μL) | 100 | 100 |
充分震荡 |
试剂四(μL) | 300 | 300 |
混匀,25℃静置10min,于微量石英比色皿/96孔板中测定500nm处吸光值A。分别记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管 |
酶活性计算公式
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.0184x+0.0002,R2=0.999
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷W
V反总:反应总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,30min
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.0092x+0.0002,R2=0.999
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0092×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0092×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷W
V反总:反应总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,30min
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