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diagnocine：DIG Labeled Blue Color Marker for Small RNA

DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物由彩色（蓝色）和 DIG 标记的 6 个单链核酸组成，其表观分子量为 RNA 的 100、75、50、40、30 和 20 个碱基。该标记物适用于监测变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗 DIG 抗体的免疫检测

图 1.DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物 (5 μl) 在 15 % 聚丙烯酰胺 - 7.5 M 尿素凝胶/1 × TBE 缓冲液作为运行缓冲液上的电泳图谱。

DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物中条带的表观大小与未染色 RNA 的大小非常一致，长度为 100、75、50、40、30 和 20 个碱基（准确度约为 95%，参见表 1） ）。用于小 RNA 的 DynaMarker DIG 标记蓝色标记物以即用型混合物形式提供，使用前不需要加热或添加变性剂。

表 1.显示了与 DynaMarker® Small RNA II 相比的表观分子量，以及适用于 DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物电泳的丙烯酰胺浓度。 （* 75 碱基 RNA 来自新合成的 RNA。75 碱基 RNA 不包含在 DynaMarker® Small RNA II 中。）

存储缓冲区

2 mM Tris-HCl (pH8.0)、8mM EDTA、78% 甲酰胺

质量控制

将 DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物在 37 °C 下孵育 24 小时后，在 15% 聚丙烯酰胺 - 7.5 M 尿素凝胶电泳中未观察到标记物明显降解。

建议上样量5 - 10 µl

电泳条件

确保在 10 - 15% 丙烯酰胺-尿素/1 × TBE 凝胶和 1 × TBE 作为运行缓冲液上使用此标记物。在其他条件下，条带无法正确分离。

笔记

为了准确地电泳测定分子量，应使用 DynaMarker® Small RNA II（代码# DM192）或 DynaMarker® Small RNA II Easy Load（代码# DM197）。

灵敏度

该标记物适用于化学发光（例如CDP-star®*1）免疫分析。灵敏度取决于高速即时胶片（例如FP-3000B*2）、X光胶片或成像仪器的曝光时间长度。下图显示了一个示例。

图 2.DynaMarker DIG 标记的小 RNA 和 hsa-miR-21 蓝色标记的检测。将 5 μl DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记和 5 μg MCF-7 总 RNA 印迹到尼龙膜上，并将 hsa-miR-21 与 DIG 标记的 DNA 探针 (2.5 nM) 杂交。使用抗 DIG-AP 抗体和 CDP-star® 检测该标记物和 has-miR-21。

*1：CDP-star® 是 Tropix, Inc. 的商标。*2：FP-3000B 是 Fujifilm Corp. 的产品。

推荐用法

DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物适用于监测变性丙烯酰胺凝胶电泳和膜上的印迹。一个例子如下所示：

• DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物的电泳和印迹

1)15%聚丙烯酰胺-7.5M尿素凝胶的制备

40 % 丙烯酰胺：双溶液 7.5 ml尿素 9.0 g10 × TBE 2.0 ml H2O 至 20 ml

尿素全溶解后，加入 20 μl TEMED 和 100 μl 10% 过硫酸铵。快速混合，然后将凝胶倒入立式凝胶装置的模具中。2)上样和电泳。使用前将 DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物全解冻。将变性的 RNA 样品和 5 μl DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物装入孔中，并使用 1 × TBE 电泳缓冲液在 200 V 下运行凝胶。 3)转移 DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物和 RNA从凝胶到膜（图 3）。

3-1)切一块比凝胶稍大的带正电的尼龙膜。将膜和四张适当尺寸的吸墨纸浸泡在 1 × TBE 缓冲液中。3-2)将两张吸墨纸放在转移池的阳极平台上。3-3)将膜放在吸墨纸上。3-4)将凝胶从玻璃板转移到膜的顶部并压出任何气泡。 （*确保膜和凝胶之间没有气泡。）3-5)将另外两张吸墨纸放在凝胶上，然后设置阴极组件。3-6)以 2 mA/cm2 传输 30 - 60 分钟。3-7)确保标记物成功转移到膜上后，除去纸和凝胶。用 2 × SSC 冲洗膜。3-8)用UV交联剂将RNA固定在膜上。3-9)进行Northern杂交(图4)。

图 3.左：(1) 5 µl DynaMarker DIG 标记的小 RNA 蓝色标记物、(2) 5 µg 人乳腺总 RNA 和 (3) 5 µg 乳腺腺癌 (MCF-7) 总 RNA 的电泳图谱12.5 % 聚丙烯酰胺 - 7.5 M 尿素凝胶/1× TBE 缓冲液作为运行缓冲液。右：将 (1) - (3) 印迹到尼龙膜上。

图 4.hsa-miR-21 和 hsa-miR-16 的检测 DIG 标记的 DNA 探针与印有乳腺总 RNA 和 MCF-7 总 RNA 的尼龙膜杂交，并用抗 DIG-AP 抗体检测探针和化学发光AP底物。

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