线粒体呼吸链复合体Ⅲ/CoQ细胞色素C还原酶测试盒-试剂盒

2024-07-24

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线粒体呼吸链复合体Ⅲ/CoQ细胞色素C还原酶测试盒

微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅲ(EC 1.10.2.2)又称CoQ-细胞色素C还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C。

测定原理:

与氧化型细胞色素C不同,还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1支,-20℃保存;

试剂六:液体2.5mL×1瓶,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  2. 将匀浆600g,4℃离心5min。

  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

  4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ(此步可选做)。

  5. 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅲ酶活性测定。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。

  2. 样本测定

(1)工作液的配制:将试剂五转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、25μL试剂六和200μL工作液,立即混匀,记录550nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

复合体Ⅲ活力单位的计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=124×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.248×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.35×10-4 L;ε:细胞色素C摩尔消光系数,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1230×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=248×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.496×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.35×10-4 L;ε:细胞色素C摩尔消光系数,1.91×104 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

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