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维生素B1测试盒
微量法100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。
测定原理
VB1在碱性条件下还原铁氰*钾生成亚铁氰*钾，亚铁氰*钾与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液：液体70mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体2mL×1支，4℃保存。
试剂三：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体3mL×1瓶，4℃避光保存。
样本处理
组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min）。
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。
血清：直接测定。
测定操作
| 空白管 | 测定管 |
样品（μL） | | 20 |
试剂一（μL） | 20 | |
试剂二（μL） | 16 | 16 |
试剂三（μL） | 20 | 20 |
充分混匀，80℃反应10min |
提取液（μL） | 16 | 16 |
试剂四（μL） | 44 | 44 |
试剂五（μL） | 24 | 24 |
H2O（μL） | 60 | 60 |
充分混匀，静置20min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。 |
计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R2 = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A（A测定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量计算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr
= 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V样总）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V样总）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017
= 58.8×（△A-0.0031）
V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b．用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0085x +0.0031，R2 = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A（A测定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量计算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A -0.0031）÷ 0.0085÷Cpr
= 117.65×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031））÷ 0.0085÷（W÷V样总）
= 117.65×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.0085÷（细胞数量÷V样总）
= 117.65×（△A-0.0031）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.0085
= 117.65×（△A-0.0031）
V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项
若测定结果中吸光值超过2，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再重新测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
显色完成后立即进行测定。
标准曲线线性范围为0.1-10μg/mL。
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