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维生素B6测试盒
微量法100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
维生素B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。
测定原理
VB6与4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在390nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液：液体70mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
样本处理
组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。
血清：直接测定。
测定操作
| 空白管 | 测定管 |
样品（μL） | | 40 |
试剂一（μL） | 40 | |
试剂二（μL） | 40 | 40 |
试剂三（μL） | 60 | 60 |
试剂四（μL） | 60 | 60 |
充分混匀，25℃反应20min，于微量石英比色皿/96孔板，测定390nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。 |
计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R2 = 0.9986
1. 按照蛋白含量计算
VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×Cpr）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×W÷V样总）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷V样
= 13.76×（△A - 0.0205）
V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b．用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.1818x+0.0205，R2 = 0.9986
1. 按照蛋白含量计算
VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反总÷（V样×Cpr）
= 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V反总÷（V样×W÷V样总）
= 27.52×（△A - 0.0205）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）
= 27.52×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反总÷V样
=27.52×（△A - 0.0205）
V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项
若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。
显色完成后立即进行测定。
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