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葡萄糖6磷酸(6PG)测试盒
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
6PG (Glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸,又称6-磷酸葡萄糖),是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物,广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中,葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸,然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸,以继续糖酵解的其它步骤;而在戊糖磷酸途径中,葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物,该过程也是生成NADPH的主要途径。此外,葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。
测定原理:
6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH,NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色,在450nm下测定吸光值。
需自备的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体12mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体1.5mL×1管,4℃避光保存。
6PG提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),8000g,25℃离心10min,取上清待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,8000g,25℃离心10min,取上清待测。
3、血清(浆)等液体样品:直接测定。
测定步骤:
1、酶标仪预热30min以上,调节波长至450nm。
2、试剂二的配制:临用前加入3mL水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存;
3、工作液的配制:临用前按照样本数量,按以下比例配制工作液
试剂名称(μL) | 测定工作液 | 对照工作液 |
试剂一 | 100 | 100 |
试剂二 | 50 | |
水 | | 50 |
试剂三 | 10 | 10 |
样本测定
按下表在96孔板中加入如下试剂
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | 50 |
测定工作液 | 150 | |
对照工作液 | | 150 |
37℃避光孵育30min,450nm下测定吸光值A测定与A对照,△A=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
6PG含量计算:
1、标准条件下测定回归方程为y = 3.8589x - 0.0016,R2= 0.997;x为6PG含量(μmol/mL),y为吸光值。
2、按照血清(浆)体积计算
6PG含量(nmol/mL)= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000
=259.1×(△A+0.0016)
3、按照蛋白浓度计算
6PG含量(nmol/mg prot)=[(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr
4、按照样品质量计算
6PG含量(nmol/g鲜重)= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W×V1÷V2)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷W
3、按照细菌或细胞密度计算
6PG含量(nmol/104cell)=[(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(500×V1÷V2)×1000
=0.518×(△A+0.0016)
V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;1000,μmol到nmol的换算系数。
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