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脂蛋白酯酶(LPL)测试盒
微量法100T/48S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
脂蛋白酯酶是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶,可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酸甘油酯,以供组织氧化供能和贮存,并在不同的组织表现出不同的生理意义。
测定原理
脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕榈酸酯产生4-硝基苯酚,在400nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、冷冻离心机、研钵、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。
试剂组成和配制
试剂一:液体105mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体4mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体10mL×1瓶,4℃保存。
样品处理
组织:按照质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL试剂一)加入试剂一,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心10min,取上清待测。
细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一)加入试剂一,冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心10min,取上清待测。
血清:直接测定。
测定操作
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL) | 20 | 20 |
试剂一(μL) | 80 | |
试剂二(μL) | | 80 |
混匀,45℃水浴10min |
试剂三(μL) | 100 | 100 |
充分混匀,25℃静置2min,于微量石英比色皿/96孔板,测定400nm处吸光值,记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管 |
计算公式
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y= 0.0581x-0.0169,R2=0.9982
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/mg prot)=(△A+0.0169)÷0.0581×V反总÷(V样×Cpr)÷T
=17.21×(△A+0.0169)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/g 鲜重)=(△A+0.0169)÷0.0581×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
=17.21×(△A+0.0169)÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每104个细胞每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/104cell)= (△A+0.0169)÷0.0581×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T
= 17.21×(△A+0.0169)÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每毫升血清每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/mL)=(△A+0.0169)÷0.0581×V反总÷V样÷T
= 17.21×(△A+0.0169)
V反总:反应总体积,0.2mL;V样:反应体系中加入样本体积,0.02mL;W:样本质量,g;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y= 0.029x-0.0169,R2=0.9982
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/mg prot)=(△A+0.0169)÷0.029×V反总÷(V样×Cpr)÷T
=34.42×(△A+0.0169)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/g 鲜重)=(△A+0.0169)÷0.029×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
=34.42×(△A+0.0169)÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每104个细胞每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/104cell)= (△A+0.0169)÷0.029×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T
=34.42×(△A+0.0169)÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:在45℃,pH7.5条件下,每毫升血清每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL活性(μmol/min/mL)=(△A+0.0169)÷0.029×V反总÷V样÷T
= 34.42×(△A+0.0169)
V反总:反应总体积,0.2mL;V样:反应体系中加入样本体积,0.02mL;W:样本质量,g;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min
注意事项
试剂三加入混匀后静置两分钟立即测定,否则影响吸光值。
吸光值过高或者测定结果不稳定,则将酶液进行适当的稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。
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