脂肪酶(LPS)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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脂肪酶(LPS)测试盒

微量法100/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

LPS又称甘油酯水解酶,催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油(或者甘油二酯和单酯)。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中LPS的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。

测定原理:

LPS催化油酯水解成脂肪酸,利用铜皂法测定脂肪酸生成速率,即可计算LPS活性。

自备仪器和用品:

研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、甲苯80mL、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体65mL×2瓶,4℃保存。

试剂二:液体10mL×1瓶,4℃保存。每次使用前用震荡混匀器剧烈震荡20min。

试剂三:甲苯80mL×1瓶,4℃保存(自备)。

试剂四:液体10mL×1瓶,4℃保存。

标准品:液体10 μL×1瓶,10 µmol/mL的标准溶液,4℃保存。临用前加入3.168 mL甲苯,充分溶解。

粗酶液提取:

  1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。

  2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后12000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

  3. 血清等液体: 直接检测。

LPS测定操作:

  1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到710 nm,蒸馏水调零。

  2. 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min。

  3. 在1.5mL EP管中依次加入下列试剂

试剂名称(μL)

空白管

测定管

蒸馏水

150

样本

50

试剂一

300

300

试剂二

100

37℃振荡反应10 min

试剂三

800

800

37℃振荡反应10 min后,8000g,25℃,离心10min,取上清液

试剂名称(μL)

空白管

测定管

标准管

上清液

400

400

标准品

400

试剂四

100

100

100

37℃振荡反应5 min后,静置5min,取200μL上层液加入微量石英比色皿/96孔板,于710nm处测定吸光值。

注意:空白管和标准管只需测定一次。

LPS活性计算公式:

1. 组织、细菌或细胞LPS活性

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol/min/mg prot) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准- A空白管)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=16×[(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol/min/g 鲜重) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=16×[(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]÷W

(3)按照细菌或者细胞数量计算

活性单位定义:37℃中每104个细胞每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol /min/104cell) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=16×[(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]÷细胞数量

2. 血清等液体LPS活性

活性单位定义:37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol /min/mL) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]×V反总÷V样÷T

=16×[(A测定管-A空白管)÷(A标准管- A空白管)]

C标准品:10 µmol/mL;V反总:反应总体积,0.8mL;V样:反应中加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;W:样本质量,g;T:催化反应时间,10 min。

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