羟脯氨酸(HYP)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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羟脯氨酸(HYP)测试盒

微量法100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

HYP是机体胶原蛋白主要成分之一,胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等,因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

测定原理:

样品经水解产生游离的HYP,进一步被氯胺T氧化,氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应,产生红色化合物,在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值,可计算HYP含量。

自备实验用品及仪器:

天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。

试剂组成和配制:

组织提取液:6mol/L盐酸,自备。浓盐酸:H2O(V/V)= 1:1,室温保存。

细胞提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体6mL×1瓶,4℃避光保存。

试剂二:液体6mL×1瓶,4℃避光保存。

羟脯氨酸提取:

  1. 组织:称取约0.2g样品于玻璃管,加入2mL的组织提取液,置于110℃烘箱,水解6至12小时,用提取液定容至2mL,12000g,25℃,离心20min,取上清待测。

  2. 细胞:取约500万个细胞,加入1mL的细胞提取液,于高压消毒器中15磅保持30min,自然降压后待测。

  3. 血清游离羟脯氨酸提取:取0.1mL血清,加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀,8000g4℃离心5min。将上清倒入另一个EP管,氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.2mL50%异丙醇,充分溶解混匀待测。

测定操作表:

  1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至560nm,蒸馏水调零。

  2. 操作表

对照管

测定管

样本(µL)

60

试剂一(µL)

60

60

混匀,室温静置20min

试剂二(µL)

60

60

H2O(µL)

180

120

混匀,60℃,20min,取出后25℃静置15 min,取200µL于微量石英比色皿/96孔板中检测560nm处吸光值。ΔA=A测定-A对照

羟脯氨酸含量计算公式:

  1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991

(1)按样品重量计算

组织羟脯氨酸含量(mg/g鲜重)=(ΔA-0.0251)÷64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)

= 0.154×(ΔA-0.0251)÷W

(2)按细菌或细胞密度计算

细胞羟脯氨酸含量(mg/104cell)=(ΔA-0.0251)÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)=0.077×(ΔA-0.0251)÷细胞数量(万个)

(3)按血清体积计算

HYP含量(mg/mL)=(ΔA-0.0251)÷ 64.875×V反总÷V样×2

=0.154×(ΔA-0.0251)

V反总:反应总体积,0.3mL;V样:反应中样品体积,0.06mL;V样总:加入提取液体积,mL;W:样本重量,g

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y=32.4375x+ 0.0251,R2=0.9991

(1)按样品重量计算

HYP含量(mg/g鲜重)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反总÷(V样÷V样总×W)

= 0.308×(ΔA-0.0251)÷W

(2)按细菌或细胞密度计算

HYP含量(mg/104cell)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)=0.154×(ΔA-0.0251)÷细胞数量(万个)

(3)按血清体积计算

HYP含量(mg/mL)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反总÷V样×2

= 0.308×(ΔA-0.0251)

V反总:反应总体积,0.3mL;V样:反应中样品体积,0.06mL;V样总:加入提取液体积,mL;W:样本重量,g;2,血清吹干后复溶的倍数。

注意事项:

  1. 吸光值大于0.8,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数。

  2. 试剂有一定的毒性,请操作时做好防护措施,防止吸入或与皮肤接触。

  3. *低检出限为3.8mg/L。

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