羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)测试盒

微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

羟甲基戊二酰辅酶A合成酶是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶,催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA。

测定原理

HMGCS催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA,同时产生CoASH,使DTNB转化为黄色的TNB,在412nm下有特征吸光值。

所需的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:粉剂×1瓶,-20℃避光保存;临用前加入3mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存;临用前加入3mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂三:6mL×1瓶,4℃避光保存。

样本测定的准备

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。

  2. 在微量石英比色皿或96孔板中加入25μL试剂一、25μL试剂二和50μL试剂三,混匀,加入100μL样本上清,迅速混匀后记录412nm下初始吸光值A1和4min后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。

HMGCS活性计算

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)活性

单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=36.76×ΔA

2、组织、细菌或细胞HMGCS活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=36.76×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/104cel)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.074×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,4min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

用96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)活性

单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=73.53×ΔA

2、组织、细菌或细胞HMGCS活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=73.53×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/104cel)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.147×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,4min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

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