总巯基测试盒-试剂盒

2024-07-24

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总巯基测试盒

微量法100T/48S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质,而且参与活性氧清除,后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量,能够间接测定蛋白质巯基含量。

测定原理:

巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)反应,生成黄色化合物,在412nm处有最大吸收峰。

自备实验用品:

天平、研钵、恒温水浴锅、酶标仪、96孔板、乙醇和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体18mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体1mL×1管,4℃避光保存。

样品的制备:

  1. 按照组织质量(g):水体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL蒸馏水)进行冰浴匀浆,然后8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

  2. 血清,培养液:稀释5倍后测定,可取0.1mL样本,加入0.4mL蒸馏水,混匀,置冰上待测。

操作步骤:

  1. 酶标仪预热30min,调节波长至412nm。

  2. 操作表

在96孔板中加入如下试剂

对照管

测定管

样品(μL)

40

40

试剂一(μL)

150

150

试剂二(μL)

10

乙醇(μL)

10

混匀,25℃静置10min,测定412nm吸光值。ΔA=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。

计算公式:

总巯基标准曲线:y = 1.8111x - 0.0037,R2= 1,x为标品浓度,单位μmol/mL,y为吸光度ΔA。

1. 组织:

(1)按样本重量计算

总巯基含量(μmol/g鲜重)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V样总÷W

=0.552×(ΔA+0.0037)÷W

(2)按样本蛋白浓度计算

总巯基含量(μmol/mg prot)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V样总÷Cpr

=0.552×(ΔA+0.0037)÷Cpr

2. 血清、培养液:

总巯基含量(μmol/L)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×5×103

=2761×(ΔA+0.0037)

V样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g ;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;5:血清,培养液等液体样本稀释倍数;103 :1mmol/ L=103μmol/ L

注意事项

*低检出限为10μmol/L。

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