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总巯基测试盒
微量法100T/48S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质,而且参与活性氧清除,后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量,能够间接测定蛋白质巯基含量。
测定原理:
巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)反应,生成黄色化合物,在412nm处有最大吸收峰。
自备实验用品:
天平、研钵、恒温水浴锅、酶标仪、96孔板、乙醇和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体18mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体1mL×1管,4℃避光保存。
样品的制备:
按照组织质量(g):水体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL蒸馏水)进行冰浴匀浆,然后8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清,培养液:稀释5倍后测定,可取0.1mL样本,加入0.4mL蒸馏水,混匀,置冰上待测。
操作步骤:
酶标仪预热30min,调节波长至412nm。
操作表
在96孔板中加入如下试剂
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL) | 40 | 40 |
试剂一(μL) | 150 | 150 |
试剂二(μL) | | 10 |
乙醇(μL) | 10 | |
混匀,25℃静置10min,测定412nm吸光值。ΔA=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。 |
计算公式:
总巯基标准曲线:y = 1.8111x - 0.0037,R2= 1,x为标品浓度,单位μmol/mL,y为吸光度ΔA。
1. 组织:
(1)按样本重量计算
总巯基含量(μmol/g鲜重)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V样总÷W
=0.552×(ΔA+0.0037)÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
总巯基含量(μmol/mg prot)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V样总÷Cpr
=0.552×(ΔA+0.0037)÷Cpr
2. 血清、培养液:
总巯基含量(μmol/L)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×5×103
=2761×(ΔA+0.0037)
V样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g ;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;5:血清,培养液等液体样本稀释倍数;103 :1mmol/ L=103μmol/ L
注意事项
*低检出限为10μmol/L。
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