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亚硝酸还原酶(NiR)测试盒
微量法100T/48S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
硝酸还原酶(NiR)是一类能催化亚硝酸盐还原的酶,广泛存在于微生物及植物体内,是自然界氮循环过程中的关键酶,可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3,从而减少环境中亚硝态氮的积累,降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
测定原理
亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO,使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少,即540nm处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。
需自备的仪器和用品
天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。
试剂的组成和配制
提取液:液体112mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体4mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加5mL蒸馏水溶解。
试剂三:液体5mL×1瓶,4℃保存。(如出现沉淀可以70-80℃加热溶解)
试剂四:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。(如出现沉淀可以70-80℃加热溶解)
试剂五:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。
工作液:临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。
酶液提取
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。
测定操作表
| 空白管 | 对照管 | 测定管 |
样本(μL) | | 20 | 20 |
蒸馏水(μL) | 20 | 40 | |
试剂一(μL) | 40 | | 40 |
试剂二(μL) | 40 | 40 | 40 |
混匀后,25℃反应1h |
试剂三(μL) | 40 | 40 | 40 |
充分震荡30S |
上清液(μL) | 70 | 70 | 70 |
工作液(μL) | 140 | 140 | 140 |
充分混匀,,静置3min后测定各管540nm处吸光值,分别记为A空白管、A对照管、A测定管。空白管只要做一管,每个测定管需设一个对照管。 |
计算公式
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值(A标准管-A空白管)。
1.按照蛋白含量计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(μmol/h/mgprot)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(V样×Cpr)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(μmol/h/g 鲜重)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义:每104个细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(μmol/h/104 cell)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷细胞数量
V标:标准液体积,0.04mL;V样:体系中加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1h;Cpr:样本蛋白含量;W:样本质量,g
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.6797x + 0.0072,R2 = 0.9997;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值(A标准管-A空白管)。
1.按照蛋白含量计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(μmol/h/mgprot)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(V样×Cpr)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(μmol/h/g 鲜重)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(W ×V样÷V样总)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义:每104个细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(μmol/h/104 cell)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷细胞数量
V标:标准液体积,0.04mL;V样:体系中加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1h;Cpr:样本蛋白含量;W:样本质量,g
注意事项
配制好的工作液3天内使用完。
若吸光值超过1.5,将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色,并在计算公式中乘以稀释倍数。
严格控制显色时间,否则会对结果有影响。
标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
A空白管-(A测定管-A对照管)线性范围为0.02-1.5。
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