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β淀粉酶测试盒
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。
测定原理:
还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐热。根据上述特性,钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:30mL×1瓶,常温保存,若有黄色晶体析出,需90℃加热溶解后再用;
试剂二:15mL×1瓶,4℃保存,若出现沉淀析出,需70℃加热溶解后再用。
粗酶液提取:
组织:称取0.1~0.2g样本(建议称取约0.1g样本),加入1mL蒸馏水,研磨匀浆;将匀浆倒入离心管中,提取液在室温下放置提取15min,每5min振荡1次,使其充分提取;3000g,25℃离心10min,取上清液加蒸馏水定容至10 mL,摇匀,即淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL蒸馏水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
血清(浆)等液体样本:(1)直接检测α-淀粉酶。(2)吸取淀粉酶原液1mL,加入4mL蒸馏水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长到540 nm,蒸馏水调零。
2、试剂一和试剂二40℃预热10min.
3、测定操作表:
试剂名称(μL) | α淀粉酶活力测定 | 总淀粉酶活力测定 |
对照管 | 测定管 | 对照管 | 测定管 |
淀粉酶原液 | 75 | 75 | | |
70℃水浴15min左右,冷却
40℃恒温水浴中准确保温5min
混匀,95度水浴5min,冷却,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,540nm处读取吸光值,从左到右分别记为A1、A2、A3和A4。每个测定管需设一个对照管。
酶活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归曲线为y=3.7215x -0.1778; x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、α淀粉酶活性
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(A2-A1+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=1.075×(A2-A1+0.1778)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=0.1075×(A2-A1+0.1778) ÷Cpr
(3)血清(浆)等液体样本中α淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A1+0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T=0.1075×(A2-A1+0.1778)
3、总淀粉酶活性计算
(1)按照样品质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min//g鲜重)=5×[(A4-A3+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=5.375×(A4-A3+0.1778)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=0.5375×(A4-A3+0.1778) ÷Cpr
(3)血清(浆)等液体样本中总淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
总淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3+0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T
=0.5375×(A4-A3+0.1778)
4、β-淀粉酶活性计算
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A3+0.1778)-1.075×(A2-A1+0.1778)]÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3+0.1778)-0.1075×(A2-A1+0.1778)]÷Cpr
(3)血清(浆)等液体样本中β-淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/mL)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A3+0.1778)-0.1075×(A2-A1+0.1778)
5:总淀粉酶稀释倍数;V反总:反应体系总体积,0.15mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.075 mL;V样总:提取液总体积,10 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归曲线为y=2.481x -0.1778; x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、α淀粉酶活性
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA+0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.612×(ΔA+0.1778)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=[(ΔA+0.1778)÷2.481×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =0.1612×(ΔA+0.1778) ÷Cpr
(3)血清(浆)等液体样本中α淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α淀粉酶活性(mg/min/mL)=[(ΔA+0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T =0.1612×(ΔA+0.1778)
3、总淀粉酶活性计算
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=5×[(A4-A3+0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=8.06×(ΔA+0.1778)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3+0.1778)÷2.481×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=0.806×(A4-A3+0.1778) ÷Cpr
(3)血清(浆)等液体样本中总淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
总淀粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A3+0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T
=0.806×(A4-A3+0.1778)
4、β-淀粉酶活性计算
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[8.06×(A4-A3+0.1778)-1.612×(A2-A1+0.1778)]÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[0.806×(A4-A3+0.1778)-0.1612×(A2-A1+0.1778)]÷Cpr
(3)血清(浆)等液体样本中β-淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/mL)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.806×(A4-A3+0.1778)-0.1612×(A2-A1+0.1778)
5:总淀粉酶稀释倍数;V反总:反应体系总体积,0.15mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.075 mL;V样总:提取液总体积,10 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。
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