N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)试剂盒-试剂盒

2024-07-24

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N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)试剂盒

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NAG是溶酶体中的一种酸性水解酶,广泛存在于各种组织、体液和细胞中,以前列腺和肾近曲小管细胞内含量最高。NAG活性变化与机体某些病理状态密切相关。

测定原理:

NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算NAG活性。

自备用品:

酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入2.5mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二:液体4mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体13mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

  1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。

2、样本测定(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL)

测定管

对照管

试剂一

25

蒸馏水

25

试剂二

35

35

样本

10

10

迅速混匀,放入37℃保温30min

试剂三

130

130

充分混匀, 400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

NAG活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.00585x +0.0083;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。

2、血清(浆)NAG活力的计算

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反总]÷V样÷T =39.89×(ΔA-0.0083)

3、细胞、细菌和组织中NAG活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反总]÷(V样×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活性(nmol/min/g鲜重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T

=0.08×(ΔA-0.0083)

V反总:反应体系总体积,0.07mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.0039x +0.0083;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。

2、血清(浆)NAG活力的计算

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反总]÷V样÷T =59.83×(ΔA-0.0083)

3、细胞、细菌和组织中NAG活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反总]÷(V样×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活性(nmol/min/g鲜重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T

=0.12×(ΔA-0.0083)

V反总:反应体系总体积,0.07mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min。

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