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bioworlde Ni-IDA 琼脂糖 6Bbioworlde Ni-IDA 琼脂糖 6B

Ni-IDA 琼脂糖凝胶 6BBD0052-2

产品名称	Ni-IDA 琼脂糖 6B
目录号	BD0052-2
分类	蛋白质相关试剂
格式	液体
内容	6%琼脂糖
储存和保质期	Ni-IDA Sepharose 6B 有 2、10、25 和 100 ml 实验室包装可供选择，以满足不同的要求。培养基在 4°C 至 30°C 的 20% 乙醇中储存更长时间。
研究用途	仅供研究使用，不得用于诊断程序。

产品名称：Ni-IDA Sepharose 6B

应用：Biogot TM Ni-IDA sepharose 6B 比其他 Ni-IDA 固定了更多的 Ni2+（看起来更蓝）。我们的 Ni-IDA 每毫升可以偶联更多的蛋白质。我们的产品由 GE Sepharose CL 凝胶制成。Sepharose 的交联形式在化学和物理上比 Sepharose 本身更具耐受性，提供相同的选择性和更好的流动特性。交联 Sepharose 凝胶对有机溶剂具有耐受性，因此是在有机溶剂中分离的选择

背景：通过固定化金属亲和层析 (IMAC) 纯化组氨酸标记的重组蛋白越来越受欢迎。镍 (Ni2+) 是 IMAC 纯化中常用的金属离子。Ni-IDA Sepharose 6B 由 90 μm 高度交联的琼脂糖珠组成，其中固定有螯合配体。然后该螯合基团带有镍 (Ni2+) 离子。与其他镍亲和层析相比，Ni-IDA 具有更高的蛋白结合能力。它具有低 Ni2+ 泄漏，并与蛋白质纯化中使用的各种添加剂兼容。其高流量特性使其非常适合放大和重力流柱纯化。

备用名称 ：推荐的缓冲液：非变性条件：结合/洗涤缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、5 mM 咪唑，pH 8.0。洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0。变性条件：结合/洗涤缓冲液：20 mM Tris-HCl、8 M 尿素、500 mM NaCl、5 mM 咪唑，pH 8.0。洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl、8 M 尿素、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0。注意：为获得最佳纯度和产量，样品和缓冲液中所需的咪唑最佳浓度因蛋白质而异。在非变性条件下，结合缓冲液中的 20-40 mM 咪唑适用于许多蛋白质。洗脱缓冲液中的 500 mM 咪唑通常足以洗脱目标蛋白。再生培养基 注意：如果要纯化相同的蛋白质，则不必在每次纯化之间剥离介质；根据细胞提取物体积、目标蛋白等，在 5-7 次纯化后重新填充培养基就足够了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除残留的 Ni2+，用 5 倍柱体积的 20 mM 磷酸钠，0.5 M 洗涤NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。根据细胞提取物体积、目标蛋白等，在 5-7 次纯化后重新填充培养基就足够了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除残留的 Ni2+，用 5 倍柱体积的 20 mM 磷酸钠，0.5 M 洗涤NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。根据细胞提取物体积、目标蛋白等，在 5-7 次纯化后重新填充培养基就足够了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除残留的 Ni2+，用 5 倍柱体积的 20 mM 磷酸钠，0.5 M 洗涤NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。为 Ni-IDA Sepharose 6B 充电，首先去除残留的 Ni2+，用 5 倍柱体积的 20 mM 磷酸钠、0.5 M NaCl、50 mM EDTA，pH 7.4 洗涤。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。为 Ni-IDA Sepharose 6B 充电，首先去除残留的 Ni2+，用 5 倍柱体积的 20 mM 磷酸钠、0.5 M NaCl、50 mM EDTA，pH 7.4 洗涤。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，然后用 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤，然后再对柱进行充电，以去除残留的 EDTA。要对水洗柱进行充电，请在蒸馏水中加载 0.5 个柱体积的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金属的盐、氯化物或硫酸盐。用 5 柱体积的蒸馏水清洗，然后用 5 柱体积的结合缓冲液（以调节 pH 值）清洗，然后储存在 20% 乙醇中。

分类 :蛋白质相关试剂

形式：液体

含量 :6% 琼脂糖

储存和保质期：Ni-IDA Sepharose 6B 有 2、10、25 和 100 ml 实验室包装可供选择，以满足不同的要求。培养基在 4°C 至 30°C 的 20% 乙醇中储存更长时间。

程序 ：样品制备：以下方案已在我们的实验室中成功使用，但其他既定程序也可能适用。1. 用于在大肠杆菌或酵母细胞质中表达的蛋白质。稀释细胞糊：每克细胞糊加入5-10 ml 结合缓冲液。样品和结合缓冲液必须含有相同浓度的咪唑，以防止宿主细胞蛋白与暴露的组氨酸结合。同时，去除大颗粒和高浓度试剂，如 EDTA、氨基酸和还原剂，这会破坏 Ni-IDA 树脂。2. 酶促裂解：0.2 mg/ml 溶菌酶、20 µg/ml DNAse、1 mM MgCl2、1 mM PMSF（终浓度）或其他蛋白酶抑制剂。抑制剂必须对 Ni 树脂的能力没有影响。然后在 +4°C 下搅拌 30 分钟。3. 机械裂解：超声处理，均化、反复冷冻/解冻或类似技术。4. 将裂解物的 pH 值调节至 pH 7.4：请勿使用强碱或强酸调节 pH 值（沉淀风险）。5. 离心裂解物：转移到管中并在室温或 +4°C 下以 12000rpm 离心 20 分钟，具体取决于蛋白质的敏感性。6. 收集上清液并进行纯化。7. 酵母、昆虫或哺乳动物表达系统分泌到培养基中的蛋白，如果上清液量大，用硫酸铵沉淀法浓缩蛋白，用1×PBS透析，然后上柱，如果是位培养上清液不含 EDTA、组氨酸或任何其他可能影响 Ni 柱的还原剂，可直接上样到柱上。笔记：您也可以将未澄清的样品应用到色谱柱（即省略上面的第 5 步）。如果是这样，稍微延长机械裂解时间，例如超声处理 10 分钟。由于未澄清样品的粘度较高，总纯化时间将增加。纯化程序： 1. 柱准备。(a) 轻轻颠倒瓶子数次，使树脂悬浮，以混合浆料。(b) 使用移液器将适当体积的 Ni 树脂浆液转移到柱中。让树脂沉降，让存储缓冲液从柱子中流出。(c) 用四床体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子或直到 A280 稳定。2. 纯化蛋白质 (a) 将蛋白质结合到树脂上。将上述含有 His 标记蛋白的可溶性澄清样品以每分钟 0.5-1 毫升的流速应用于柱子。收集并保存流经以供分析。(b) 洗涤。用八床体积的结合/洗涤缓冲液洗涤柱子或直到 A280 在每分钟 1 毫升的流速下稳定。(c) 目标蛋白的洗脱。用五到十床体积的洗脱缓冲液洗脱多组氨酸标记的蛋白质。根据目标蛋白的具体应用，收集洗脱物并在 20 mM Tris-HCl pH 8.0 或 1×PBS，pH 7.4 中透析。3. 在变性条件下从大肠杆菌中纯化多组氨酸标记蛋白（主要在包涵体中表达）： (a) 在 1× PBS 中重悬细胞沉淀（每 ml 沉淀约 5 ml），并通过超声破碎细胞如上所述。(b) 将裂解物以 12,000 rpm 离心 10 分钟，收集包涵体。必要时用 1× PBS 清洗包涵体数次。(c) 将包涵体溶解在结合/洗涤缓冲液中（每 ml 沉淀约 5 ml），并在室温下孵育 30-60 分钟。可能需要均质化或超声处理才能溶解沉淀。(d) 以 12,000 rpm 的速度离心 30 分钟以去除任何残留的不溶性物质。小心地将上清液转移到干净的管中，不要干扰颗粒，并将其加载到用结合/洗涤缓冲液预平衡的 Ni 柱上。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。并在室温下孵育 30-60 分钟。可能需要均质化或超声处理才能溶解沉淀。(d) 以 12,000 rpm 的速度离心 30 分钟以去除任何残留的不溶性物质。小心地将上清液转移到干净的管中，不要干扰颗粒，并将其加载到用结合/洗涤缓冲液预平衡的 Ni 柱上。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。并在室温下孵育 30-60 分钟。可能需要均质化或超声处理才能溶解沉淀。(d) 以 12,000 rpm 的速度离心 30 分钟以去除任何残留的不溶性物质。小心地将上清液转移到干净的管中，不要干扰颗粒，并将其加载到用结合/洗涤缓冲液预平衡的 Ni 柱上。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。000 rpm 30 分钟以去除任何残留的不溶性物质。小心地将上清液转移到干净的管中，不要干扰颗粒，并将其加载到用结合/洗涤缓冲液预平衡的 Ni 柱上。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。000 rpm 30 分钟以去除任何残留的不溶性物质。小心地将上清液转移到干净的管中，不要干扰颗粒，并将其加载到用结合/洗涤缓冲液预平衡的 Ni 柱上。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。(e) 用结合/洗涤缓冲液洗涤柱子 3-4 次，直到 280 nm 处的吸收接近于零。(f) 用最小体积的洗脱缓冲液洗脱。注意：此处推荐的过程是从包涵体中纯化蛋白质，此过程洗脱的蛋白质可能需要重新折叠以获得活性和可溶性蛋白质。

研究用途：仅供研究使用，不得用于诊断程序。

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