为了研究RNA的功能，通常通过逆转录（RT）将RNA转化为更稳定的互补DNA（cDNA）。cDNA可通过克隆、PCR和测序等技术研究RNA，因此，逆转录是许多RNA实验工作流程的关键步骤。

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

在RT-PCR中，通过逆转录（RT）将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增cDNA（图1）。利用cDNA扩增步骤，有望对初始RNA进行进一步研究，即便RNA样本数量有限或低丰度表达。RT-PCR的常见应用包括表达基因检测、转录物变异检测，以及克隆和测序用cDNA模板制备。

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

图1. 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT =逆转录，RTase =逆转录酶

由于逆转录可为PCR扩增和下游实验提供cDNA模板，因此，它是实验成功的关键步骤之一。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率，即便是难转录RNA样本，如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的RNA样本。

一步法和两步法是两种最常用的RT-PCR方法，每种方法都具有各自的优缺点（图2）。

顾名思义，一步法RT-PCR在单个反应管中将第一链cDNA合成（RT）和后续PCR反应结合在一起。该反应设置可简化工作流程、减少结果差异，并将污染的可能性降至最低。一步法RT-PCR简化了大量样本的处理，适用于高通量应用。但是，一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增，将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆转录和扩增条件，因此，一步法RT-PCR在某些情况下可能具有较低的灵敏度和效率。但是，在RT-PCR中使用基因特异性引物，有助于最大化目标cDNA的得率，并最小化扩增背景。

One-step vs. two-step RT-PCR

图2. 一步法和两步法RT-PCR的比较。

两步法RT-PCR包含两个独立反应，首先进行第一链cDNA合成（RT），然后在单个反应管中通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。因此，两步法RT-PCR可用于检测单个RNA样本中的多个基因。RT和PCR反应独立进行，可对每个步骤的反应条件进行优化，使逆转录引物选择（oligo（dT）引物、随机六聚体或基因特异性引物）和PCR反应建立（如DNA聚合酶选择和PCR组分）更灵活。与一步法RT-PCR相比，两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤以及提高污染和结果变异的可能性。

表1. 对比一步法和两步法RT-PCR

两步法RT-PCR

反应建立   单独优化的逆转录和PCR反应

引    物   oligo(dT)、随机六聚体或基因特异性引物

最佳用途   分析多种基因

优    势   灵活

一步法RT-PCR

反应建立 在同时支持逆转录和PCR的条件下，将两个反应结合在一起

引物 基因特异性引物

最佳用途 分析一种或两种基因；高通量平台

优势 方便，高通量