一、普通PCR技术

KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7）

Kary Mullis于1983年发明了聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction ，PCR），据说是载着女友开车的时候，忽然灵光一闪，想到了PCR原理（论开车的好处）。Kary Mullis于1993 年获诺贝尔化学奖。《纽约时报》如此评价：" 具有高度原创性和重大意义，几乎将生物学分为 PCR 前和 PCR 后两个时代。

PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

普通PCR的优点

经典方法，国际和国内标准齐全

仪器试剂成本较低

PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验

普通PCR的缺点

容易污染

操作繁琐

只能定性分析

敏感性中等

存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分

基于毛细管电泳的PCR

针对普通PCR的缺点，一些厂家推出了基于毛细管电泳原理的仪器，将PCR扩增后电泳的步骤在毛细管中完成，灵敏度更高，可以区分几个碱基的差异并且通过MAERKER可以计算出扩增产物的含量。缺陷是仍然需要将PCR产物打开后放入仪器，仍然存在很大的污染风险。

二、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）技术

荧光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。荧光定量PCR的发展史是一部ABI、罗氏和伯乐等巨头的荡气回肠的斗争史，感兴趣的可以去查查。该技术是目前最成熟，使用最广泛的半定量PCR技术。

荧光染料法（SYBR Green I）：

SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。由于染料是与双链DNA的非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

荧光探针法（Taqman 技术）：

PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' —— 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。临床检测中Taqman探针法是最常用的检测方法。

qPCR的优点

方法成熟，配套仪器试剂齐全

试剂成本中等

操作简单

检测敏感性高，特异性高

qPCR的缺点

1.目的基因发生突变导致漏检

2.低浓度模板检测结果无法确定

3.使用标准曲线进行定量检测时误差较大。

三、数字PCR（digital PCR ，dPCR）技术

数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接读出DNA/RNA分子的个数，是对起始样品核酸分子的绝对定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。

2006年，Fluidigm公司第一个生产商业化的基于芯片的dPCR仪。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系统，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系统，采用高密度的纳升级微流控芯片技术，将样本均匀的分配至20 000个单独的反应孔中。

2011年，Bio-Rad公司推出了基于微滴的QX100 dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20 000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1 000万个皮升级别微滴的反应乳液。

   至此数字PCR就形成了2大派别，芯片式和微滴式。不论是哪种数字PCR，其核心原理都是有限稀释，终点PCR和泊松分布。将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成几万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。

dPCR的优点

实现绝对定量

更高的敏感性和特异性

可以检测低拷贝样品

dPCR的缺点

1.仪器设备和试剂昂贵

2.操作复杂，检测时间长

3.检测范围较窄

目前三代的PCR技术各有各的优缺点，也各有各的应用领域，并不是一代取代一代的关系。技术的不断进步给PCR技术注入了新的活力，使其能解锁一个又一个的应用方向，使核酸检测更方便、更准确。