总RNA提取试剂-试剂盒

2024-07-24

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RNApure(TRIzol)是广谱型总RNA提取试剂。实验操作快速方便,颜色鲜明,便于分层。本试剂适用范围广泛,可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等 样品中提取总RNA。样品在RNApure中被充分裂解的同时能够***限度地保证RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液会分成三层:上层无色水相、中间层和下层红色有机相, RNA分布在上清层中。收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。提取的总 RNA完整性好,无蛋白和DNA污染,可用于各种分子生物学常规实验,如RT-PCR、 Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等。

自备试剂

氯仿(新开封或提取 RNA 专用)、无水乙醇。

操作步骤

1.各种材料的处理

1)植物组织:取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在 RNApure中迅速研磨,每 30-50 mg 组织加入 1ml RNApure,涡旋混匀。

注意:样品体积一般不要超过 RNApure 体积的 10%。

2)动物组织:取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎,每 30-50mg 组织加入 1mlRNApure,匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入 1ml RNApure 混匀。

注意:样品体积一般不要超过 RNApure 体积的 10%。

3)单层培养细胞:吸去培养液,可直接在培养板中加入适量 RNApure(每 10cm²面积需要 1ml RNApure),用取样器反复吹打使细胞裂解。也可用胰蛋白酶处理后,将细胞溶液转移至 Rnase-free 的离心管中,13000×g 离心 5 分钟,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清,加入 1ml RNApure 混匀。

注意:a. 收集细胞数量不要超过 1×10⁷。

b. RNApure 加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定。如果 RNApure 加量不足,可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污染。

c. 收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不全,造成 RNA 的产量降低。

4)细胞悬液:离心收集细胞。每 5×10⁶-1×10⁷动物、植物和酵母细胞或每 10⁷细菌细胞加入 1 ml RNApure。

注意:

a. 加入 RNApure 前不要洗涤细胞,以免 RNA 降解。

b. 一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪或液氮研磨处理。

5)血液处理:直接取新鲜的血液,加入 3 倍体积 RNApure(推荐 0.25ml 全血加入 0.75mlRNApure),充分振荡混匀。

6)可选步骤:对于蛋白、脂肪、多糖或胞外物质含量高的样品,如肌肉组织、脂肪组织或植物的块茎,可以在匀浆处理后 4℃,13,000×g 离心 10 分钟以除去不溶物质,此时沉淀中含胞外物质、多糖和高分子量的 DNA,而 RNA 存在于上清中。

2.样品中加入 RNApure 后反复吹打几次,使样本充分裂解。室温放置 5 分钟,使蛋白核酸复合物*全分离。

3.以每 1ml RNApure 加入 200ul 氯仿的比例加入氯仿,盖好管盖,剧烈振荡 15 秒,室温放置 2 分钟。

4.4℃ 13,000×g 离心 10 分钟,此时样品分为三层:红色有机相,中间层和上层无色水相,RNA 主要在上层水相中,将上层水相移到一个新的 Rnase-free 离心管(自备)中。

5.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置 10 分钟。

6.4℃ 12,000×g 离心10分钟,弃上清。

7.加入75%乙醇(用Rnase-free Water配制)洗涤沉淀。每使用1ml RNApure用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤。

8.4℃ 12,000×g 离心3分钟,小心吸弃上清,注意不要吸弃RNA沉淀。

注意:剩余的少量液体可短暂离心,然后用枪头吸出,注意不要吸弃沉淀。

9.室温放置 2-3 分钟,晾干。加入 30-100ul Rnase-free Water,充分溶解 RNA,得到的RNA 保存在-70℃,防止降解。

注意:沉淀不要过分干燥,以免难于溶解。

本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及其他用途

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总RNA提取试剂

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