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维生素E测试盒
微量法100T/48S
测定意义
维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素,其水解产物为生育酚,是生物体中最主要的抗氧化剂之一,能阻止不饱和脂肪酸收到过氧化作用的损伤,维持不饱和脂肪酸细胞膜的完整性和正常功能,具有延缓衰老、预防溶血性贫血作用,在医药、化妆品、保健品、食品行业具有较高的应用价值。
测定原理
VE还原Fe3+为Fe2+,Fe2+与1,10-菲罗啉产生有色络合物,在530nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、漩涡震荡仪。
试剂组成和配制
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体2mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体2mL×1支,4℃保存。
试剂三:液体2mL×1支,4℃保存。
试剂四:液体6mL×1瓶,4℃保存。
样本处理
组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,匀浆后用提取液定至1mL,定至在漩涡混匀仪上震荡5min,于25℃,5000g离心10min,取上层测定。
细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min)后在漩涡混匀仪上震荡5min,于25℃,5000g离心10min,取上层测定。
血清:取0.1mL,加0.9mL提取液,漩涡仪混匀上震荡5min,于25℃,5000g离心10min,取上层测定。
测定操作
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL) | 100 | 100 |
试剂一(μL) | 20 | 20 |
试剂二(μL) | | 20 |
试剂三(μL) | 20 | |
充分混匀,25℃反应5min |
试剂四(μL) | 60 | 60 |
充分混匀,于微量石英比色皿/96孔板,无水乙醇调零,测定530nm处吸光值,记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管。 |
计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.22x + 0.0065 R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量计算
VE含量(μg/mg prot)=(△A -0.0065)÷ 0.22×V反总÷(V样×Cpr)
= 9.09×(△A -0.0065)÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VE含量(μg/g)= (△A -0.0065)÷ 0.22×V反总÷(V样×W÷V样总)
= 9.09×(△A -0.0065)÷ W
3. 按照细胞数量计算
VE含量(μg/104 cell)=(△A -0.0065)÷ 0.22×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)
= 9.09×(△A -0.0065)÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VE含量(μg/mL)=(△A -0.0065)÷ 0.22×V反总÷V样×10
= 90.9×(△A -0.0065)
V反总:反应总体积,0.2mL;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g
用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.11x + 0.0065 R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量计算
VE含量(μg/mg prot)=(△A -0.0065)÷ 0.11×V反总÷(V样×Cpr)
= 18.18×(△A -0.0065)÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VE含量(μg/g)= (△A -0.0065)÷0.11×V反总÷(V样×W÷V样总)
= 18.18×(△A -0.0065)÷ W
3. 按照细胞数量计算
VE含量(μg/104 cell)=(△A -0.0065)÷ 0.11×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)
= 18.18×(△A -0.0065)÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VE含量(μg/mL)=(△A -0.0065)÷0.11×V反总÷V样×10
= 181.8×(△A -0.0065)
V反总:反应总体积,0.2mL;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g
注意事项
若反应体系产生沉淀,需要将样品进行适当的稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。
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