α淀粉酶测试盒-试剂盒

2024-07-24

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α淀粉酶测试盒

正式测定前请取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

淀粉水解酶,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。

测定原理:

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖,还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质,在540 nm有吸收峰;通过测定540 nm吸光度增加速率,计算淀粉酶活性。α-AL耐热,但是β-淀粉酶可在70℃钝化15min。因此粗酶液经过70℃钝化15min,就只有α-AL能够催化淀粉水解。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体15mL×1瓶,室温保存。若有黄色晶体析出,可90℃加热溶解后再用。

试剂二:液体7.5mL×1瓶,4℃保存。若有沉淀析出,可70℃加热溶解后使用。

粗酶液提取:

组织:称取0.1~0.2g样本(建议称取约0.1g样本),加1 mL蒸馏水匀浆;将匀浆倒入离心管中,在室温下放置提取15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取;3000g,25℃离心10min,吸取上清液并且加蒸馏水定容至10 mL,摇匀,即为淀粉酶原液。

血清(浆):直接检测。

操作步骤和加样表(在EP管中依次加入下列试剂):

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长到540 nm,蒸馏水调零。

  2. 试剂一和试剂二40℃预热10min。

3、测定步骤:

试剂(μL)

对照管

测定管

α淀粉酶原液

75

75

70℃水浴15min左右,流水冷却。

蒸馏水

75

试剂二

75

在40℃恒温水浴中准确保温5min

试剂一

150

150

混匀,95度水浴5min,冷却,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,540nm处读取吸光值,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

α-淀粉酶活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归曲线为y=3.7215x -0.1778; x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。

2、α淀粉酶活性

(1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.075×(ΔA+0.1778)÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(ΔA+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=0.1075×(ΔA+0.1778) ÷Cpr

(3)血清(浆)样本中α淀粉酶活性计算

单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA+0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T=0.1075×(ΔA+0.1778)

反总:反应体系总体积,0.15mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.075 mL;V样总:提取液总体积,10 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归曲线为y=2.481x -0.1778; x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。

2、α淀粉酶活性

(1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA+0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.612×(ΔA+0.1778)÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=[(ΔA+0.1778)÷2.481×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =0.1612×(ΔA+0.1778) ÷Cpr

(3)血清(浆)样本中α淀粉酶活性计算

单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA+0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T=0.1612×(ΔA+0.1778)

V反总:反应体系总体积,0.15mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.075 mL;V样总:提取液总体积,10 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。

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