α半乳糖苷酶(αGAL)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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α半乳糖苷酶(αGAL)测试盒(比色法),α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供最初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

测定原理:

α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。

自备用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入2.5mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二:液体4mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体13mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。

2、样本测定(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL)

测定管

对照管

试剂一

25

蒸馏水

25

试剂二

35

35

样本

10

10

迅速混匀,放入37℃保温30min

试剂三

130

130

充分混匀, 400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

α-GAL活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.00585x -0.0027;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反总]÷(V样×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

V反总:反应体系总体积,0.07mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0039x -0.0027;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反总]÷(V样×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

V反总:反应体系总体积,0.07mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min。

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