α酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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α酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)测试盒

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

测定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1瓶,-20℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  2. 将匀浆600g,4℃离心5min。

  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

  4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH(此步可选做)。

  5. 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体α-KGDH活性测定。

测定步骤

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

  2. 样本测定

(1)在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min;现配现用;

(2)在试剂六中加入1mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.65×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=650×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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