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蛋白质羰基测试盒
微量法100T/48S
注意:正式实验之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志,其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小,是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。
测定原理:
羰基与2,4-二硝*苯肼反应生成红色2,4-二硝*苯腙,在370nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。
试剂组成和配制:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂0.1g×5支,4℃避光保存。(使用前根据样品数,每支加1mL水溶解,每支为10个样品用量)
试剂二:液体6mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体6mL×1瓶,4℃保存。
试剂四:液体15mL×1瓶,4℃保存。
试剂五:根据测定样品量,将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。
试剂六:液体60mL×1瓶,4℃保存。
样品处理:
组织样品:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,于4℃,4000g离心10min,取上清,加入0.1mL试剂一,室温放置10min,4℃,10000g离心10min,取上清待测。
细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
血清等液体样本:直接测定。
测定步骤和操作表:
分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至370nm。
操作表
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL) | 60 | 60 |
试剂二(μL) | | 120 |
试剂三(μL) | 120 | |
混匀,37℃避光反应1h |
试剂四(μL) | 150 | 150 |
静置5min,4℃,12000g离心15min,弃上清,留沉淀 |
试剂五(μL) | 300 | 300 |
漩涡混匀,4℃,12000g离心10min,弃上清,留沉淀 |
试剂五(μL) | 300 | 300 |
漩涡混匀,4℃,12000g离心10min,弃上清,留沉淀 |
试剂五(μL) | 300 | 300 |
漩涡混匀,4℃,12000g离心10min,弃上清,留沉淀 |
试剂六(μL) | 300 | 300 |
漩涡混匀,37℃温育15min,沉淀全部溶解后,4℃,12000g离心15min,取上清200μL于微量石英比色皿/96孔板中,测定A370。ΔA=A测定管-A对照管 |
计算公式:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷(V样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr
按照样本重量计算
蛋白质羰基含量(μmol/g鲜重)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷(W ×V样÷V样总) =0.227×ΔA370÷W
3. 按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷(细胞数量×V样÷V样总) =0.227×ΔA370÷细胞数量
按照液体体积计算
蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷V样=0.227×ΔA370
V反总:反应体系总体积,0.3mL;ε:羰基毫摩尔消光系数,22L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.06 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,W:样本质量,g
用96孔板测定的计算公式如下
1. 按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷(V样×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr
2. 按照样本重量计算
蛋白质羰基含量(μmol/g鲜重)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷(W ×V样÷V样总) =0.454×ΔA370÷W
3. 按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷(细胞数量×V样÷V样总) =0.454×ΔA370÷细胞数量
4. 按照液体体积计算
蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V反总÷(ε×d)]÷V样=0.454×ΔA370
V反总:反应体系总体积,0.3mL;ε:羰基毫摩尔消光系数,22L/mmol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.06 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,W:样本质量,g
注意事项:
1. 试剂一使用前根据要测定的样品数现配,配置好后4℃保存,若变为黑色,则不能使用。
2. 试剂二见光易分解,反应需严格避光。
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