花青素还原酶(ANR)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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花青素还原酶(ANR)测试盒

微量法100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

花青素还原酶是黄酮合成途径中的关键酶,在植物体内起非常重要的调控作用,对花青素还原酶的调控机制研究有利于从基因水平改变植物的品质。

测定原理

花青素还原酶在NADPH存在的条件下作用于飞燕草色素转变为表没食子儿茶素和NADP,使反应体系在340nm处的吸光值下降,吸光值下降速率反应了花青素还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、研钵、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

酶液提取

  1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

  2. 培养液等液体:直接检测。

测定操作表

试剂名称

测定管

试剂一(μL)

150

试剂二(μL)

10

酶液(μL)

20

试剂三(μL)

10

试剂四(μL)

10

充分混匀,于微量石英比色皿/96孔板测定340处吸光值A1,然后在40℃温育20min后,再测定340nm处吸光值A2,△A=A1-A2

酶活性计算公式

  1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在40℃,pH6.5条件下,每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

ANR活性(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

=80.39×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活性定义:在40℃,pH6.5条件下,每克组织每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

ANR活性(nmol/min/g 鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T

= 80.39×ΔA÷W

  1. 按液体体积计算

酶活性定义:在40℃,pH6.5条件下,每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

ANR活性(nmol/min/mL)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T

= 80.39×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,20min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

  1. 用96孔板测定的计算公式如下

(1)按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在40℃,pH6.5条件下,每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

ANR活性(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

=160.78×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活性定义:在40℃,pH6.5条件下,每克组织每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

ANR活性(nmol/min/g 鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T

= 160.78×ΔA÷W

(3)按液体体积计算

酶活性定义:在40℃,pH6.5条件下,每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

ANR活性(nmol/min/mL)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T

= 160.78×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,20min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

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