脲酶(UE)测试盒-试剂盒

2024-07-24

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脲酶(UE)测试盒

微量法100管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

UE能够水解尿素,产生氨和碳酸。UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关,反应了氮素状况。

测定原理:

利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、甲苯(不允许快递)和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:粉剂×1瓶,临用前加入9mL蒸馏水,充分溶解待用,4℃保存;用不完的试剂4℃保存;

试剂二:液体22mL×1瓶,4℃保存;

试剂三A液:液体×1支,4℃保存;试剂三B液:液体×1瓶,4℃保存;临用前将A液倒入B液中混合,待用;用不完的试剂4℃保存一周;

试剂四:液体2mL×1瓶,4℃保存;

样本的前处理:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至578nm,蒸馏水调零。

2、酶促反应

试剂名称

测定管

对照管

样本(μL)

20

20

试剂一(μL)

90

蒸馏水(μL)

90

试剂二(μL)

190

190

混匀,放入37℃水浴1h后,10000g 25℃离心10min,取上清液。

2、将上清液稀释10倍(取0.1mL上清液,加入0.9mL蒸馏水)。

3、测氨量(在微量石英比色皿或96孔板中加入下列试剂)

测定管

对照管

稀释后的上清液(μL)

80

80

试剂三(μL)

15

15

试剂四(μL)

15

15

充分混匀,室温放置20min

蒸馏水(μL)

90

90

混匀,于578nm处,蒸馏水调零,读吸光值A,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

UE活力计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0915x +0.0373;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值A。

1、血清(浆)UE活力的计算:

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/mL)=(ΔA-0.0373)÷0.0915×10×V反总÷V样÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

单位的定义:每天每g土样中产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

2、组织、细菌或细胞中1μg NH3-N活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373)÷0.0915×10×V反总÷(V样×Cpr)÷T=27.32×(ΔA -0.0373)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0373)÷0.0915×10×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T=27.32×(ΔA -0.0373)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/104cell)=(ΔA-0.0373)÷0.0915×10×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.0546×ΔA

10:稀释倍数;T:反应时间,60min;V反总:反应体系总体积:0.3mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.04575x +0.0373;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值A。

1、血清(浆)UE活力的计算:

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/mL)=(ΔA-0.0373)÷0.04575×10×V反总÷V样÷T=54.64×(ΔA -0.0373)

单位的定义:每天每g土样中产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

2、组织、细菌或细胞中1μg NH3-N活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373)÷0.04575×10×V反总÷(V样×Cpr)÷T=54.64×(ΔA -0.0373)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0373)÷0.04575×10×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T=54.64×(ΔA -0.0373)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/104cell)=(ΔA-0.0373)÷0.04575×10×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.1092×ΔA

10:稀释倍数;T:反应时间,60min;V反总:反应体系总体积:0.3mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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