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脱氢酶(DHA)测试盒
微量法100管/96样
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
脱氢酶(dehydrogenase,DHA)是一类催化物质氧化还原反应的酶,催化底物通过细胞色素系统被氧化,释放的能量供机体使用,是生物体取得能量的一种方式。
测定原理
在细胞呼吸过程中,氢受体2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC)在脱氢酶作用下接受氢以后,被还原为三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone, TF),TF呈现红色,于485nm测定其吸光值,即得脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸馏水、甲醇(不允许快递,请用户自备)。
试剂的组成和配制
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存
试剂一:粉剂×1瓶,使用前加10mL试剂二溶解,4℃避光保存(尽量现配现用)。
试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:甲醇,自备。
样品处理
细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后8000g,4℃,离心20min。
液体:直接检测。
测定步骤和操作表
| 空白管 | 测定管 |
样品(μL) | | 100 |
蒸馏水(μL) | 100 | |
试剂一(μL) | | 100 |
试剂二(μL) | 100 | |
充分混匀,37℃培养24h |
试剂三(μL) | 900 | 900 |
振荡1h,8000g,25℃,离心5min,取200μL上清于微量石英比色皿/96孔板,测定A485,△A=A测定-A空白管。空白管只要做一管。 |
脱氢酶活力计算
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y =0.0422x - 0.0312;R2= 0.9988;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活单位定义:在37℃时,每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /mg prot)=(△A+0.0312)÷0.0422×V反总÷(Cpr×V样)÷T= 0.181×(△A+0.0312)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活单位定义:在37℃时,每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /g 鲜重)=(△A+0.0312)÷0.0422×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 0.181×(△A+0.0312)÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义:在37℃时,每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /mL)=(△A+0.0312)÷0.0422×V反总÷V样÷T= 0.181×(△A+0.0312)
V反总:反应总体积,1.1mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;T:培养时间,1d=1440min;W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mL。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y =0.0211x - 0.0312;R2= 0.9988;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活单位定义:在37℃时,每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /mg prot)=(△A+0.0312)÷0.0211×V反总÷(Cpr×V样)÷T= 0.362×(△A+0.0312)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活单位定义:在37℃时,每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /g 鲜重)=(△A+0.0312)÷0.0211×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 0.362×(△A+0.0312)÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义:在37℃时,每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /mL)=(△A+0.0312)÷0.0211×V反总÷V样÷T= 0.362×(△A+0.0312)
V反总:反应总体积,1.1mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;T:培养时间,1d=1440min;W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
配制好的试剂一避光保存于4℃,最好在一周内使用,若出现红色,则不能使用。
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