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土壤植酸酶测试盒
微量法100T/48S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植酸酶(phytase)是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶,它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷,降低粪便中的磷含量,减轻对环境的污染,改善营养成分的吸收和利用,因此具有极其广泛的研究和应用价值。
测定原理
植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物,无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物,在700nm处有特征吸收峰,根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、酶标仪、96孔板、恒温水浴锅,甲苯(不允许快递)。
试剂的组成和配制
缓冲液:液体60mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,4℃避光保存,临用前加缓冲液30mL配制,现用现配;用不完的试剂4℃保存一个月。
试剂二:液体15mL×1瓶,4℃保存。
显色剂:粉剂×6管,4℃避光保存,临用前根据用量每瓶加0.4mL双蒸水溶解,再加1.6mL试剂二混匀。
样本处理
新鲜土样自然风干或37度烘箱风干,过30~50目筛。
测定操作表
| 对照管 | 测定管 |
样本(g) | 0.03 | 0.03 |
甲苯 | 20 | 20 |
振荡混匀,室温放置15min |
缓冲液(µL) | 500 | |
试剂一(µL) | | 500 |
混匀,37℃孵育24h,10000g,4℃离心5min,取上清 |
上清 | 100 | 100 |
显色剂(µL) | 100 | 100 |
混匀,静置15min,测定700nm处吸光值,△A=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。 |
酶活性计算公式
标准曲线:y = 0.8795x + 0.0084,R2= 0.9977;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值△A。
酶活性定义:在37℃,pH5.5的条件下,每克土样每小时从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性(μmol/h/g 土样)=(△A-0.0084)÷0.8795×V反总÷W÷T
=0.82×(△A-0.0084)
V反总:反应总体积,0.52mL;T:反应时间,24h;W:样本质量,0.03g。
注意事项
1、显色剂需要临用前根据用量配制,每一瓶是10个样本的用量,新配制的显色剂若有颜色则已经污染或者试剂过期,应放弃使用。
2、ΔA线性范围为0.01-0.5。
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