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几丁质酶测试盒
微量法100T/48S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨),以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解,具有抵御真菌侵染的作用,成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理:
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖,进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物,在585nm处有特征吸收峰,吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、甲苯(土壤样品专用)和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体105mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体5mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体5mL×1瓶,4℃保存。(若出现结晶,可80℃左右加热溶解后使用)
试剂三:液体5mL×1瓶,4℃保存。
试剂四:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。
粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心20min,取上清,置冰上待测。
真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心20min,取上清置于冰上待测。
培养液:直接测定。
测定操作表:
| 对照管 | 测定管 |
粗酶液(µL) | 80 | 80 |
提取液(µL) | 120 | 40 |
试剂一(µL) | | 80 |
混匀,37℃水浴1h |
试剂二(µL) | 40 | 40 |
混匀,沸水浴7min,5000rpm,4℃,离心10min,取上清200µL。 |
试剂三(µL) | 40 | 40 |
试剂四(µL) | 80 | 80 |
混匀,37℃,15min,于微量石英比色皿/96孔板,测定A585,ΔA=A测定-A对照。 |
计算公式:
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.3088-0.003,R2=0.9995
计算公式:
按照样本重量计算
酶活性定义:37℃条件下,每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(mg/h/g鲜重)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=8.096×(ΔA+0.003)÷W
按照蛋白质浓度计算
酶活定义:37℃条件下,每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h mg prot)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 8.096×(ΔA+0.003)÷Cpr
按细胞数量计算
酶活定义:37℃条件下,每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h /104 cell)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=8.096×(ΔA+0.003)÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义:37℃条件下,每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷V样=8.096×(ΔA+0.003)
V反总:反应体系总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.4mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL
用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.1544x-0.003,R2=0.9995
计算公式:
按照样本重量计算
酶活性定义:37℃条件下,每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(mg/h/g鲜重)=(ΔA+0.003)÷0.1544×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=16.192×(ΔA+0.003)÷W
按照蛋白质浓度计算
酶活定义:37℃条件下,每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h mg prot)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 16.192×(ΔA+0.003)÷Cpr
按细胞数量计算
酶活定义:37℃条件下,每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h /104 cell)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=16.192×(ΔA+0.003)÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义:37℃条件下,每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+0.003)÷0.3088×V反总÷V样=16.192×(ΔA+0.003)
V反总:反应体系总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.4mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL
注意事项:
反应结束后立即进行比色。
试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。
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